روش تهیه مقاطع بافتی

روش تهیه مقاطع بافتی

برای تهیه مقاطع بافتی برای مشاهده در زیر میکروسکوپ می بایست بر روی بافت مورد نظر عملیات خاصی انجام شود که مجموع این عملیات را گردش بافت  یا پاساژ میگویند.این اعمال شامل مراحل زیر میباشد.

 به ادامه مطلب بروید

آب گیری
آبگیری به مفهوم خارج کردن کامل آب از بافت است. بافتها به طور طبیعی،حتی بعد از ثابت شدن، دارای مقداری آب هستند که اگر از بافت خارج نشود مانع نفوذ پارافین به داخل بافت میشود. برای این منظور آب اضافی بافت با مواد جاذب آب گرفته میشود. بدین منظور معمولاً از الکل اتیلیک با غلظت افزایشى استفاده میشود. برای شروع آبگیری درجه ی الکل اولیه بسته به نوع ماده ی فیکساتور ، اندازه و جنس بافت دارد و معمولاً با الکل اتیلیک 50 یا 70 درجه شروع میشود. اگر بافت در الکل غلیظ قرار بگیرد، چروکیده میشود ،چون آب آن خیلی سریع خارج میشود.

پس از جدا کردن بافت از بقیه ى بخشها، ابتدا فرمالین نمونه ی بافتی را با کاغذ خشک کن میگیریم. در صورتی که ضخامت نمونه ها زیاد (حدود یک سانتیمتر) باشد، با استفاده از سوزن و با دقت و ملایمت سوراخهایی در سطح نمونه ایجاد میکنیم تا عمل آبگیری به سرعت انجام شود. سپس نمونه ها را به شیشه های در سنبادهای محتوی الکل اتیلیک70 درجه، وارد میکنیم. بنابراین، به طور خلاصه، مراحل آبگیری به صورت زیر انجام میشود:

-       الکل اتیلیک 70 درجه، 24 ساعت

-       الکل اتیلیک 90 درجه 1 تا 6 ساعت

-       الکل اتیلیک 90 درجه 2 تا 6 ساعت

-       الکل اتیلیک 96 درجه 12 ساعت

 

شفاف سازی

شفاف سازی به مفهوم شفاف ساختن بافت نیست، هر چند که این حالت نیز ممکن است در بعضی از موارد اتفاق افتد. مفهوم شفافسازی جانشین کردن مایع جاذب)الکل اتیلیک(با حلال ماده ای است که نمونه می باید در آن قالب گیری شود.

به علاوه، چون درجه ی انکسار نور در بافتها مشابه یا نزدیک هم است، لازم است درجه ی انکسار تغییر یابد. بدین منظور، عمل شفافسازی انجام میشود. شفاف کردن علاوه بر این که درجه ی انکسار بافت را بالا میبرد، از سخت شدن بافتها نیز جلوگیری میکند. برای شفاف کردن از محلولهایی مثل گزیلن، تولوئن بنزن، بوتانل و ... استفاده میشود.

نمونه های بافتی را بعد از خارج کردن از الکل اتیلیک 96 درجه ابتدا خشک میکنند. مراحل شفافسازی با استفاده از محلول بوتانل به ترتیب زیر انجام میشود :

-       بوتانل اول 14 ساعت

-       بوتانل دوم 12 ساعت

-       بوتانل سوم 10 ساعت

باید دقت کنیم که حجم بوتانل در حدود 50 تا 100 برابر نمونه بافتی باشد.

آغشته سازی

آغشته سازی یا پارافین گیری به مفهوم اشباع کردن کامل بافت با ماده ای است که نمونه باید در آن قالب گیری شود. درروش مخصوص مقاطع پارافینی، این عمل به مفهوم خارج کردن کامل عامل شفاف کننده )بوتانل( و جانشین کردن آن با پارافین است. پارافین گیری در اتو با دمای 54 تا 60 انجام میشود. دمای اتو باید همواره ثابت باشد.آغشته سازی با یکی ازروشهای دستی، اتوماتیک و یا در خلأ انجام میشود.

یک روز قبل از شروع مرحله ی آغشتگی، پارافین جامد را در اتویی که دمای آن 58 درجه ی سانتیگراد است، قرارمی دهیم. بعد از ذوب شدن پارافین، در هریک از بشرهایی که قبلاً تهیه شده اند، 50سی سی پارافین مذاب میریزیم. سپس نمونه های بافتی را بعد از خروج از بوتانل سوم ابتدا با کاغذ خشک کن، خشک وسپس به آرامی وارد بشرهای محتوی پارافین مذاب، که مشخصات مربوط به نمونه روی آن درج شده است، میکنیم بشرها را در اتویی که دمای آن روی 58 درجه ی سانتیگراد تنظیم شده است، قرارمیدهیم. بعد از 8 ساعت پارافین نمونه ها را با پارافین جدید، تعویض میکنیم تعویض پارافین را چهار بار انجام و هر بارنمونه ها به مدت 8 ساعت درون پارافین مذاب قرار میدهیم.

 

قالب گیری

در این مرحله نمونه ی بافتی آغشته شده به پارافین را در داخل پارافین مذاب و در وضعیت کاملاً مناسب قرار میدهیم. ضمن انجماد پارافین، نمونه نیز در داخل آن باقی میماند و آماده ی مقطع گیری میشود.

یکی از مسائل مهم در جهت گیری یعنی قرار دادن بافت به طور دقیق و صحیح در قالب است. این جایگذاری باید قبل از انجام عملیات بافت شناسی مشخص شود و برای قالب گیری و تهیه ی بلوک انواع مختلفی از قالبها استفاده میشود. در این روش از قالبهای آلومینیومی استفاده میشود.

لازم است قبل از شروع کاربرچسب هایی متناسب با نمونه ها تهیه کنیم. مراحل تهیه ی بلوک را به صورت زیر انجام میدهیم:

1.      ابتدا مقداری پارافین مذاب در کف قالب (که در یک سطح صاف مثل کاشی قرار داده میشود) میریزیم تا سفت شود، سپس بقیه ی پارافین مذاب را روی آن میریزیم تا سفت شود.

2.      با پنس گرم نمونه های بافتی را درپارافین قرار میدهیم. دقت کنیم که حباب تشکیل نشود.

3.      سطح برش را به طرف کف ظرف قرار میدهیم.

4.      برچسب یا نمره را در سطح مقابل سطح برش قرار میدهیم، به گونه ای که قابل خواندن باشد.

5.      وقتی پارافین کاملاً سرد شد، قالبها را به یخچال منتقل میکنیم.

6.      بعد از 1 تا 2 ساعت پارافین به خوبی سفت و سخت میشود و می توان بلوکها را از قالب آلومینیومی خارج کرد.

  به این ترتیب بلوکهای پارافینی حاوی نمونه ی بافتی برای مقطع گیری کاملاً آماده اند. باید دقت کنیم که در هر قالب بیش از 30 میلیمتر پارافین روی بافت را بپوشاند. لذا اندازه ی قالب را باید متناسب با اندازه ى بافت انتخاب کنیم.

 

برش بافت یا مقطع گیری

در این مرحله نمونه های دارای قالب پارافینی را با دستگاهی به نام میکروتوم به ضخامت 5 تا 10 میکرون برش میدهیم.

قبل از برش برداری، باید بلوک تراشیده و روی پایه نصب شود. سطوح جانبی بلوک تا حاشیه ی بافت و سطوح فوقانی و تحتانی آن تا 5 میلیمتری مانده به بافت را میتراشیم. باید توجه داشت که همه ی سطوح بلوک به حالت موازی باشد. در این حالت بلوک پارافین برای نصب روی پایه آماده است. علاوه براین، قبل از شروع به کار باید دمای حمام آب را به 40 تا 50 درجه سانتیگراد رساند. همچنین لازم است تعدادی لام به تعداد مورد نیاز تهیه کنیم و با استفاده از قلم الماس کد بلوک و نیز شماره ی برش را به صورت سریال روی آ نها درج کنیم.

بلوک را در گیره ی میکروتوم جای میدهیم، به طوری که سطح بالا و پایین آن به موازات لبه ی تیغ قرار گیرند، گیره و بلوک را در جای خود قفل و میکروتوم را برای تهیه ی مقاطع 8 میکرونی تنظیم میکنیم. سطح بلوک را تراش میدهیم تا کاملاً صاف شود. هنگامیکه تیغ میکروتوم به محل نمونه رسید، مقاطع را به کمک قلم مو یا پنس با ملایمت برمیداریم و درسطح حمام آب شناور میکنیم. مقاطع کامل بعد از پهن شدن، با فرو بردن لام در حمام آب با زاویه ی 45 درجه و بالا آوردن آن به صورت عمودی از سطح آب جمع آوری میکنیم. باید دقت کنیم که حتی الامکان مقاطع در وسط لام قرارگیرند.

همچنین در صورتی که مقاطع بزرگ باشند، برای هر لام فقط یک مقطع کافی است. لامها را به آرامی روی یک سطح صاف در دمای آزمایشگاه قرار میدهیم.. لامهای تهیه شده را در جعبه ی لام میچینیم و برای خشک شدن کامل در اتو (دمای 37 درجه ی سانتیگراد) قرار میدهیم. بعد از 24ساعت لامها جهت رنگ آمیزی نمونه ها آماده اند. هر چند که بیشتر مقاطع قدرت چسبیدن به لامهای خشک را دارند، ولی معمولاً برای چسبیدن بهتر مقاطع به لام توصیه میشود که از مواد چسباننده استفاده شود. تعداد زیادی ماده‌ی چسباننده (مثل گلیسرین، آلبومین، پلاسما، خمیر نشاسته و ژلاتین) برای این منظور موجود است.

رنگ آمیزی

هدف از رنگ آمیزی متمایز کردن سلولها، اجزای سلولی و عناصر تشکیل دهنده ی بافتها از نظر نوری،برای مطالعه ی میکروسکوپی است.واکنشهای رنگ آمیزی بر سه اصل حلالیت، جذب و آغشتگی استوارند. روش رنگ آمیزی معمولی، یعنی استفاده از هماتوکسیلین وائوزین، روش متداول در اکثر آزمایشگاه هاست.

هماتوکسیلین نوعی رنگ بازی است و ساختارهایی را که با آن رنگ میگیرند به رنگ آبی تا بنفش درمی آورد. این ساختارها به ساختارهای بازوفیل موسوم اند. ائوزین نوعی ماده ی رنگی اسیدی است و ساختارهایی را که با آن رنگ میشوند به رنگ قرمز در می آورد. این ساختارها به ساختارهای اسیدوفیل یا ائوزینوفیل موسوم اند. با این روش رنگ آمیزی هسته ها به رنگ آبی و سیتوپلاسم به رنگ قرمز در می‌آیند.

به طور کلی قبل از آنکه مقاطع پارافینی را رنگ آمیزی کنیم، باید پارافین را از مقطع خارج کنیم و آبدهی نیز انجام دهیم. برای حذف کردن پارافین از گزیلن (زایلن)و برای آبدهی از الکل اتیلیک با درجات نزولی استفاده میکنیم. بعد از رنگ آمیزی، مقاطع احتیاج به آبگیری و شفا ف سازی دارند. عمل آبگیری با استفاده از الکل مطلق و شفاف سازی با زایلن انجام میشود. بنابراین، روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین به این صورت انجام میشود.

 چسبانیدن

چسباندن که اصطلاحاً مونته کردن مقاطع نیز نامیده میشود، به این مفهوم است که بعد از رنگ آمیزی و قبل از مطالعه ی مقطع، باید روی آن لامل قرارگیرد تا حمل و نقل آن آسان باشد و از آسیب دیدن مقطع جلوگیری به عمل آید.

مواد مونته کننده به دو گروه تقسیم میشوند:

1. مواد آبی مثل ژله ى گلیسرین، محیط آپاتی و محیط فارانت.مواد آبی هنگامی برای مونته کردن به کار میروند که رنگ توسط الکل برداشته شده و یا از بین میرود مثل رنگ آمیزی چربی(سودان).
2. مواد رزینی مثل کانادا بالسام،دپکس و انتلان، که در زایلن یا تولوئن حل میشوند.

 

ضریب انکسار مواد مونته کننده باید حتی الامکان نزدیک به شیشه باشد. برای چسباندن ابتدا زیادی زایلن را از اطراف مقطع پاک میکنیم.  سپس یک یا دو قطره انتلان را بر مقطع میریزیم و اجازه میدهیم تا همه ی سطح مقطع را آغشته کند. مقدار واقعی ماده ی مونته کننده مورد نیاز بستگی به اندازه مقطع دارد. در مرحله بعد لامل را به طور مایل به مقطع نزدیک میکنیم و آن را به آرامی روی ماده ی مونته کننده قرار میدهیم. هرگونه حباب هوا را با فشردن آرام لامل و یا به ضربات ملایم از بین میبریم. زیادی انتلان را میتوان با زایلن پاک کرد.

لامهای تهیه شده پس از 72 ساعت کاملاً خشک میشوند. سپس میتوان با محلول اسید الکل 3 درصد (3سی سی اسید کلریدریک در 7 سی سی الکل اتیلیک 96درجه) لامها را کاملاً تمیز و شفاف کرده. پس از حذف انتلان اضافی به کمک تیغ اسکالپل لامها آماده مطالعه میشوند.